Immunohistochimies

L’immunohistochimie (IHC) est une technique d’histologie visant à localiser une protéine donnée dans un tissu.

Principe

Le principe de l’immunohistochimie repose sur la reconnaissance d’un antigène par un anticorps spécifique et la révélation de ce complexe antigène-anticorps par une réaction chimique grâce à une enzyme et son substrat ou à l’aide d’un marqueur fluorescent.

Cette technique est largement utilisée dans les laboratoires de recherche ou pour le diagnostic clinique.

Notre équipe réalise des marquages par méthode directe (anticorps couplé directement à un marqueur) et indirecte (anticorps primaire non marqué et reconnu spécifiquement par un anticorps secondaire visualisé par un marqueur) sur différents types de tissus : prélèvements et biopsies, d’origine humaine ou animale, inclus en paraffine ou congelés.

Méthode directe

La méthode directe est une méthode IHC en une seule étape. L’anticorps marqué réagit directement avec l’antigène dans des coupes de tissus. Cette technique utilise un seul anticorps et la procédure est courte et rapide. Cependant, elle est moins sensible en raison de la faible amplification du signal et donc rarement utilisée.

Méthode indirecte

La méthode indirecte implique un anticorps primaire non marqué qui réagit avec l’antigène tissulaire et un anticorps secondaire marqué qui se lie à l’anticorps primaire (Remarque : l’anticorps secondaire doit être dirigé contre les immunoglobulines de l’espèce animale dans laquelle l’anticorps primaire a été produit). Cette méthode est plus sensible en raison de l’amplification du signal due aux multiples réactions de l’anticorps secondaire sur les différents sites antigéniques de l’anticorps primaire.

Méthode ABC

La technique indirecte nécessite parfois une troisième étape. Un anticorps secondaire biotinylé est utilisé pour reconnaitre l’anticorps primaire. La biotine va réagir avec un complexe composé d’avidine (marquée avec une enzyme ou un fluorochrome) et de biotine.

Révélations

Les méthodes de détection mises en œuvre dépendent directement du type de traceur utilisé.

Immunofluorescence

La visualisation se fait à l’aide d’un marqueur fluorescent (FITC, Alexa 488, Alexa 555, …). L’immunomarquage des protéines d’intérêt en fluorescence est généralement associé à une contrecoloration des noyaux par le DAPI qui colore les acides nucléiques. Cette technique d’immunofluorescence est largement utilisée pour réaliser des co-marquages.

Couplée à un logiciel de traitement de l’image, cette technique permet également de générer des données d’intensité de fluorescence pouvant faire l’objet d’une analyse quantitative.

Immunohistochimie en fond clair

Dans ce cas, la visualisation se fait par une réaction enzymatique (peroxydase, la phosphatase alcaline ou la glucose oxydase). L’enzyme est ensuite révélée à l’aide d’un chromogène tel que la diaminobenzidine (DAB) ou un autre substrat pour produire différents produits finaux colorimétriques et visibles en microcopie à fond clair.

Exemples d’immunohistochimies réalisées sur ou par la plateforme :

  • Myeline basic protein (MBP) pour évaluer les lésions de la myéline dans un modèle de sclérose en plaque
  • Tyrosine hydroxylase (TH) pour évaluer la perte en neurone dopaminergique dans la maladie de Parkinson
  • IBA1 pour évaluer l’inflammation

Multiplex

L’immunohistochimie en multiplex est une technique plus récente qui permet de réaliser de multiples immunomarquages séquentiellement et donc d’étudier de nombreux co-marquages.

Principe

Elle est basée sur le système d’amplification de signal par la Tyramide

Méthode 

  • Le premier immunomarquage est réalisé sur la coupe
  • La peroxydase conjuguée à l’anticorps secondaire catalyse la conversion des molécules de tyramide en radicaux libres hautement réactifs qui vont former des liaisons covalentes à proximité de l’épitope
  • L’élimination du couple anticorps primaires/anticorps secondaires par chauffage (« stripping ») préserve la TSA liée et le fluorochrome rapporteur
  • Le processus peut être répété avec un nouvel anticorps primaire, jusqu’à ce que toutes les cibles d’intérêt soient détectées, en utilisant un fluorochrome de longueur d’onde différente pour chaque marquage.

La technologie repose sur la capacité :

  • De la TSA couplée au fluorochrome à être liée de manière covalente aux tissus
  • À éliminer efficacement les anticorps entre les cycles de coloration
  • Des antigènes à résister à la chaleur

Avantages de la technologie

  • Signal augmenté (x10 à x100)
  • Résolution exceptionnelle
  • Volume d’anticorps primaires utilisé réduit
  • Diminution du temps d’incubation (min 1h)
  • La liaison covalente établit par la technique est idéal pour le multiplexage

A disposition sur la plateforme

Anticorps secondaires (différentes espèces & différents couplages)

Système de révélation (ABC, DAB, VIP, multiples chromogènes)

Protocoles établis disponibles sur demande, mais les protocoles spécifiques fournis par les utilisateurs sont également les bienvenus.

Mise en place de nouveaux protocoles utilisant des anticorps commerciaux ou non commerciaux: différentes méthodes de fixation, d’immunomarquages, de systèmes de détection sont évaluées afin d’optimiser et de valider les nouveaux protocoles.

Livrables

Lames immunomarquées et/ou numérisées

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