Techniques Spéciales

Transparisation des tissus

La transparisation des tissus est une technique récente qui permet de rendre les organes optiquement transparents afin de faciliter leur observation au microscope. Elle permet de visualiser un environnement complexe (eg cerveau) dans son intégralité sans recourir à des coupes sériées.

 

Méthode Clarity

Principe

Étape 1 : Perfusion et post-fixation des échantillons

Etape 2 : Imprégnation et polymérisation dans un hydrogel

Étape 3 : Transparisation qui va permettre l’élimination des lipides et homogénéiser l’indice de réfraction de l’échantillon.

Etape 4 : Réalisation de l’immunomarquage si besoin

 

Avantages de cette méthode :

Immunomarquage facilité car réalisé après l’élimination des lipides

Rapidité

Préservation des signaux fluorescents endogènes (YFP, GFP, …)

 

Equipement disponible sur la plateforme :

Set Up X Clarity (Logos Biosystems)

 

Méthode iDisco

Principe

Etape 1 : Blanchiement et perméabilisation des échantillons

Etape 2 : Immunomarquage

Etape 3 : Transparisation chimique permettant l’élimination des lipides

Etape 4 : Imprégnation dans le milieu de montage

 

Avantages de la méthode :

Préservation de la morphologie et de la taille des échantillons

Meilleure résolution à l’acquisition des images

Recommandation :

N’hésitez pas à nous contacter

Livrable :

Echantillons transparisés avec ou sans immunomarquage

 

Microdissection Laser

Préparation des échantillons

La préparation des échantillons est une étape fondamentale avant la microdissection. Il faut prendre en compte les contraintes liées à l’analyse en aval (ex. quantification d’ARNm, dosage de protéine etc.).
En général, les tissus frais et congelés sont préférés pour isoler l’ARN et les protéines. Les coupes congelées peuvent être obtenues rapidement sur un cryostat. Un ARN de haute qualité est obtenu à partir de tissus congelés immédiatement après la chirurgie, ce qui minimise sa dégradation au fil du temps par les RNases (activité tissu dépendant).
L’ADN, L’ARN peuvent aussi être préparés à partir de matériel congelé ou fixé au formol, même après enrobage paraffine. L’avantage de travailler avec des coupes enrobées de paraffine est une qualité morphologique supérieure par rapport aux coupes congelées. La préservation de la morphologie peut être critique pour le diagnostic et pour la sélection finale de cellules spécifiques à microdisséquer. Cependant, la préparation d’ARN à partir de coupes de paraffine fixées peut être difficile en raison de la dégradation de l’ARN par le formol (fixateur généralement utilisé pour les inclusions en paraffine).

Apres microdissection, les échantillons sont récupérés dans des tubes et l’extraction (ARN, ADN, Protéine) réalisée rapidement.

Equipements disponibles sur la plateforme :

1 LMD7000 (Leica) lien vers page équipement

 

Recommandations

N’hésitez pas à nous contacter pour la préparation et la coupe au cryostat avant microdissection

 

Livrable

Tubes avec échantillons microdisséqués