Préparation des échantillons

Fixation

La fixation est une étape critique dans la préparation des coupes histologiques. Elle permet de minimiser les altérations tissulaires liées au délai post mortem et de préserver les structures cellulaires dans un état aussi proche possible que celui du vivant. Si elle n’est pas réalisée dans des conditions optimales ou si la fixation est retardée, un échantillon de tissu peut être irréversiblement endommagé. En l’absence de fixation, les informations morphologiques et histochimiques pouvant être obtenues à partir de l’échantillon seront compromises.

Le choix du protocole de fixation peut dépendre des analyses finales prévues

Méthodes de fixation

Les méthodes décrites ci-dessous sont les plus couramment utilisées en histologie:

Physique – Congélation

La congélation (abaissement brutal de la température à ‐20°C ou plus) empêche l’autolyse.

La congélation directe préserve les antigènes, les graisses, les ARN et l’activité enzymatique.

La fixation par congélation permet de préserver l’ADN/ARN et une antigénicité excellente des tissus mais aux dépens de leur morphologie (artéfacts de congélation).

Recommandation

L’utilisation de l’Isopentane est recommandée pour une meilleure préservation des tissus. C’est un excellent conducteur qui permet une congélation plus rapide.

Chimique – Aldehydes

La fixation avec les aldéhydes crée de liaisons covalentes entre les protéines (réticulation ou « cross-linking »). Elle permet la préservation des lipides et des acides nucléiques et assure une bonne fixation du cytoplasme (organelles). La fixation peut être réalisée soit par immersion des tissus prélevés, soit par perfusion intracardiaque en péri-mortem. Cette dernière méthode permet une meilleure pénétration des fixateurs et est plus efficace pour la préservation des tissus et des organes. Elle est privilégiée pour l’immunohistochimie

Exemples de fixateurs : glutaraldehyde, formaldehyde

Recommandations

Il est préférable de réaliser une fixation par immersion sur de petits échantillons. Le volume du fixateur doit être de 10 à 20 fois le volume des échantillons de tissus. En général, une augmentation de la température augmente la vitesse de fixation mais également le taux d’autolyse et de diffusion des éléments cellulaires. Traditionnellement, une température de 4° C est considérée comme la température idéale pour la fixation des échantillons. Le pH doit être maintenu dans une plage physiologique, entre 7,2 et 7,4 pour la conservation de l’ultrastructure.

Après leur fixation, les échantillons destinés aux coupes à congélation doivent être cryoprotégés (DMSO, glycérol, sucrose) avant leur congélation afin d’éviter la formation de cristaux de glace.

Inclusion en paraffine

Traitement des tissus

Le but est d’éliminer l’eau des tissus et de la remplacer par un milieu qui se solidifie pour permettre la réalisation de coupes fines (4 à 5µm). Pour cela, le tissu biologique doit être inclus dans une matrice dure (paraffine). Les principales étapes de ce processus sont la déshydratation, la clarification et l’imprégnation.

Déshydratation

Les échantillons fixés dans des solutions aqueuses ne peuvent être imprégnés en paraffine directement. L’eau des tissus doit être éliminée par déshydratation dans une succession de bains d’éthanol de concentration croissante (70%, 95% à 100%).

Clarification

Bien que le tissu soit maintenant essentiellement exempt d’eau, il ne peut toujours pas être imprégné dans la paraffine car celle-ci est non miscible dans l’éthanol. Il faut utiliser un solvant intermédiaire miscible à la fois dans l’éthanol et dans la paraffine. L’agent de clarification le plus couramment utilisé est le xylène.

Imprégnation

Les tissus sont ensuite imprégnés dans la paraffine puis placés et orientés dans des moules et  enrobés afin de produire des blocs en cassettes destinés à la coupe..

Recommandations :

Les os doivent être décalcifiés avant déshydratation.

Après la fixation, les échantillons peuvent être stockés dans une étape de déshydratation avec de l’éthanol à 70%, mais ne doivent pas être conservés dans l’éthanol absolu plus de 2 heures car cela durcit les tissus. Pour la même raison, les échantillons ne doivent pas être stockés dans la solution de clarification (xylène).